Os agonistas do peptídeo GLP-1, como a Liraglutida (Victoza®), têm se mostrado eficazes no tratamento de diabetes tipo 2 e obesidade, mas suas propriedades únicas tornam a caracterização por HPLC e LC-MS desafiadora. A Liraglutida difere do GLP-1 nativo por uma substituição de aminoácido na posição 34 e pela ligação de um ácido graxo C16 na posição 26 via acilação, o que aumenta sua meia-vida de aproximadamente 10 minutos para cerca de 13 horas, melhorando a interação com a albumina e a distribuição no organismo. Ela apresenta alta homologia com o glucagon, um peptídeo que estimula a liberação de glicose pelo fígado, e é produzida recombinante em leveduras, sendo purificada antes da análise de GC (Garantia de Qualidade).
Métodos tradicionais de HPLC, como os descritos para glucagon, utilizam tampão fosfato a pH 2,7 e colunas L1, sendo incompatíveis com LC-MS. Agentes fortes de pareamento iônico, como ácido trifluoroacético ou fosfato, podem causar supressão de íons e problemas nos instrumentos, enquanto agentes mais fracos, como ácido fórmico, reduzem esse risco, mas podem comprometer a qualidade da separação em colunas C18 padrão, gerando cauda de pico em compostos básicos.
As colunas HALO® 160 Å PCS C18, de fase reversa positivamente carregada, foram projetadas para separações de alta qualidade de peptídeos e proteínas mesmo na presença de agentes fracos, como ácido fórmico, permitindo o desenvolvimento de um único método compatível tanto com HPLC-UV para GC quanto com LC-MS/MS para caracterização detalhada.
Neste estudo, a coluna HALO® 160 Å PCS C18 permitiu identificar diversas impurezas da Liraglutida, incluindo uma ciclagem do terminal N, catalisada por base na presença de traços de formaldeído, separando rapidamente essas impurezas do analito principal e garantindo resultados confiáveis.
Confira abaixo o cromatograma, assim como as condições cromatográficas e de detecção por espectrometria de massas que possibilitaram a obtenção desses resultados.
Figura 1: Análise detalhada da Liraglutida. Painel superior: cromatograma obtido por gradiente longo, mostrando o pico principal em 43,82 min (analito de interesse) e um pico de impureza em 46,06 min. Painéis intermediário e inferior: espectros de massas correspondentes, evidenciando os diferentes estados de carga e pequenas variações de massa (Da) relacionadas a impurezas ou modificações da molécula.
O cromatograma apresentado no painel superior mostra a separação da amostra em função do tempo de retenção. O pico principal, observado em 43,82 minutos, corresponde à Liraglutida nativa, enquanto um segundo pico relevante aparece em 46,06 minutos, indicando a presença de uma impureza. Pequenos sinais adicionais podem ser atribuídos a ruído ou a impurezas de menor significância. Dessa forma, o cromatograma evidencia que a amostra é composta majoritariamente por Liraglutida, mas também contém uma impureza próxima no tempo de retenção.
O espectro de massas correspondente ao pico principal (43,82 min), mostrado no painel do meio, apresenta a razão massa/carga (m/z) característica da Liraglutida. O sinal dominante é observado em torno de 1251 m/z no estado de carga +3, valor esperado para este peptídeo, confirmando a identidade da molécula por meio da relação de massas.
Já o espectro de massas associado ao pico secundário (46,06 min), ilustrado no painel inferior, apresenta um padrão semelhante ao do analito principal, mas com um deslocamento de +12 Da em relação à Liraglutida nativa. Esse desvio é consistente com uma modificação química no terminal N, atribuída a um processo de ciclagem induzido pela presença de traços de formaldeído, conforme descrito na literatura.
A coluna HALO 160 Å PCS C18 demonstrou excelente desempenho na separação do analito e de suas impurezas. O pico principal foi bem resolvido, com alta eficiência cromatográfica, evidenciada pela boa definição e simetria do pico. Tanto no gradiente longo quanto no gradiente rápido, a coluna manteve consistência na retenção e na resolução, permitindo uma separação clara entre o composto de interesse e as impurezas próximas.
Acesse agora esta nota de aplicação para conferir todos os detalhes: